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Resumen
En este estudio se estandarizó una metodología para la caracterización molecular de cepas nativas de Bacillus thuringiensis, la cual se basó en la amplificación de los genes cry mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se utilizaron cuatro mezclas de oligonucleótidos: dos Generales (I y II), los cuales reconocen genes de las familias cry1, cry2, cry3, cry4 y cry1Ia, y dos Específicos (A y B), que identifican los genes de la familia cry1 (cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ba, cry1Ca y cry1Da). La calidad y concentración del ADN bacteriano influyó sobre la especificidad y concentración de los productos obtenidos mediante la amplificación de los genes cry. La calidad del ADN purificado a través del método rápido reportado por M. He et al. (Nucleic Ac. Res. 18:1660, 1990) permitió una amplificación eficiente. Para realizar la PCR en condiciones óptimas, se utilizó una mezcla de reacción con un volumen final de 20 µl, la cual contenía 0,4 µM de cada oligonucleótido, 1X PCR buffer (50 mM KCL, wmM Tris-HCl, pH 8,3 y 3,0 mM MgCl 2), 200 µM de cada dNTP y 1U de Taq-ADN-polimerasa, además de 10-100 y 300- 500 ng de ADN bacterial para las mezclas de los oligonucleótidos Generales y Específicos, respectivamente. El programa de amplificación incluyó 30 ciclos de desnaturalización a 94°C, hibridación a 53°C y síntesis a 72°C durante 20 segundos cada uno. La metodología estandarizada se puede utilizar rutinariamente para amplificar los genes cry procedentes de aislamientos nativos de B. thuringiensis, lo cual permite clasificarlos y seleccionarlos de una manera rápida y precisa de acuerdo con su actividad biológica y potencial biotecnológico; adicionalmente, como paso previo de los ensayos de toxicidad contra diversas especies de insectos plaga de interés agrícola.
Javier Hernández, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Agrosavia)
Programa Nacional de Biotecnología Agrícola. A.A. 240142. Las Palmas, Santa Fe de Bogotá D.C.
Leonardo Mariño, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Agrosavia)
Programa Nacional de Biotecnología Agrícola. A.A. 240142. Las Palmas, Santa Fe de Bogotá D.C.Martha Orozco, Washington State University, Pullman, WA 99164, U.S.A.
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